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本制品是基于重组酶介导链置换核酸扩增（RPA）技术开发的恒温核酸扩增检测试剂，在39～42℃恒温条件下特异识别并扩增目标样本的核酸片段，可配合电泳法、实时荧光或通用型核酸检测试纸条进行检测判断。

• 本制品是即用型RT-RPA冻干颗粒。
  
• 含有除引物和探针外所有的反应要素，如重组酶、逆转录酶、dNTP、ATP和PEG 35000等。
  
• 试剂盒最低检测下限为10～100 copies/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）。
  
• 适用于电泳法分析条带。

• 引物设计要求：建议的引物长度在28～35个核苷酸之间，引物序列中应避免回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区，建议在进行RPA扩增反应之前，先进行引物的筛选试验，以便获得较高的检测灵敏度。
  
• 探针设计要求：建议的探针长度在46～52个核苷酸之间，探针序列中同样应避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，探针内部可以包含碱基核苷酸类似物替换核苷酸以提高杂交稳定性。探针THF上游和下游标记发光基团和淬灭基团，探针的3’末端应包含聚合酶延伸阻断基团，以防止非特异性延伸，在开始实验前，请检查探针5’端标记的基团与下游引物5’端标记的基团是否与所用的试纸条或检测平台相匹配。
  
• 用自选方法进行核酸提取与释放。
  
• 反应体系如下：
  

  单管反应体系
  成分	用量
  上游引物(10μM)	1.0μL
  下游引物(10μM)	1.0μL
  探针(10μM，根据实验需要决定是否加入)	0.25μL
  RNA样本和水	21μL
  280mM醋酸镁溶液	1.25μL
  RT-RPA扩增反应预混冻干球	1颗

  
  
• 根据反应数量，按照反应体系配制含有水、10μM上游引物、10μM下游引物的Mix，根据实验需要决定是否加入10μM的探针，混合均匀后加入装有RT-RPA冻干颗粒的检测单元管中。
  
• 向检测单元管中加入待测RNA样本。
  
• 再向检测单元管盖上加入1.25μL的280mM醋酸镁溶液，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5～6次，低速离心10sec。
  
  本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性。
  
  
• 反应程序设置为：42℃ 30秒，共40循环。
  
• 扩增结束后，扩增产物需再次经历核酸提取或纯化。
  
• 琼脂糖凝胶电泳检测RT-RPA扩增结果。
  
• 若加入探针，则可观察扩增曲线。